恩諾(nuò)沙星-過(guò)氧化物(wù)酶(méi)標記物的(dí)製(zhì)備(bèi)方(fāng)法主要有以(yǐ)下幾種(zhǒng)：

戊二醛法(fǎ)

• 原理：戊二醛作(zuò)為雙功(gōng)能交聯劑，能(néng)與過(guò)氧化(huà)物酶(méi)和(hé)恩諾(nuò)沙星的氨基結合，形成穩定的標(biāo)記物
  。

• 操作步驟：

• 將恩(ēn)諾沙星(xīng)和(hé)過(guò)氧化(huà)物酶(méi)分別溶(róng)解(jiě)於適當的緩衝液中，如(rú)0.01mol/L pH 7.2的磷酸鹽(yán)緩(huǎn)衝(chōng)液
  。

• 按一(yī)定比(bǐ)例混(hùn)合恩諾(nuò)沙星(xīng)和過(guò)氧化物(wù)酶溶(róng)液，加入適量的戊(wù)二(èr)醛，使戊(wù)二醛(quán)的終濃(nóng)度(dù)為0.1%-0.5%
  。

• 室溫下(xià)攪拌反(fǎn)應2-4小時(shí)，或4℃過夜(yè)
  。

• 反應(yīng)結束後(hòu)，用透析(xī)袋(dài)對0.01mol/L pH 7.2的(dí)磷(lín)酸鹽(yán)緩衝液(yè)透析，去(qù)除(chú)未反(fǎn)應的(dí)戊二醛(quán)和(hé)其他小(xiǎo)分子(zǐ)雜質
  。

• 透析後的標(biāo)記(jì)物可加入(rù)適(shì)量的甘油，分裝後於(yú)-20℃保存(cún)
  。

過(guò)碘(diǎn)酸(suān)鈉法

• 原理：過碘酸(suān)鈉可(kě)將(jiāng)過(guò)氧化(huà)物酶(méi)的糖基(jī)氧(yǎng)化(huà)成(chéng)醛(quán)基(jī)，醛基與恩(ēn)諾沙(shā)星(xīng)的氨基結(jié)合(hé)形(xíng)成(chéng)Schiff氏鹼(jiǎn)，再用(yòng)硼(péng)氫(qīng)化(huà)na還(huán)原(yuán)穩(wěn)定
  。

• 操(cāo)作(zuò)步驟：

• 溶解過(guò)氧(yǎng)化物酶於0.1mol/L NaHCO3溶(róng)液中，加入新配(pèi)製(zhì)的0.1mol/L NaIO4溶(róng)液，室溫避(bì)光(guāng)反應(yīng)20-30分鐘
  。

• 反應後(hòu)的溶液裝入透(tòu)析袋(dài)，對(duì)0.001mol/L pH 4.0的醋(cù)酸緩衝液透(tòu)析過夜，期(qī)間(jiān)更換透析液(yè)幾(jī)次(cì)
  。

• 將(jiāng)恩(ēn)諾(nuò)沙星用(yòng)0.01mol/L碳酸(suān)緩衝(chōng)液稀(xī)釋至一定濃(nóng)度，並用(yòng)0.01mol/L碳(tàn)酸(suān)緩(huǎn)衝液將(jiāng)活(huó)化好的過氧化物(wù)酶(méi)溶液pH調(tiáo)至9.5左右(yòu)
  。

• 將恩諾沙星溶液加(jiā)入過(guò)氧(yǎng)化(huà)物酶(méi)溶液中(zhōng)，室(shì)溫或(huò)4℃反應2小時(shí)
  。

• 加入新鮮(xiān)配製的(dí)5mg/ml NaBH4溶(róng)液，室(shì)溫作用(yòng)30分(fēn)鐘(zhōng)，再加(jiā)入適(shì)量NaBH4溶液(yè)，室溫或4℃過(guò)夜(yè)
  。

• 最後對(duì)0.01mol/L PBS透(tòu)析過夜，加入(rù)保(bǎo)存(cún)液於-20℃保存
  。

改良過碘(diǎn)酸鹽氧化(huà)法

• 原(yuán)理(lǐ)：與過(guò)碘酸鈉法類(lèi)似，也(yě)是通過(guò)過(guò)碘酸鹽氧(yǎng)化(huà)過氧化物酶(méi)，使(shǐ)其產生醛基(jī)，然後與(yǔ)恩(ēn)諾(nuò)沙(shā)星的氨基結合(hé)，形成穩定的標記(jì)物(wù)
  。

• 操作步驟：

• 溶解(jiě)過氧(yǎng)化(huà)物酶於超純(chún)水(shuǐ)中，加(jiā)入新配(pèi)製(zhì)的(dí)0.1mol/L多碘(diǎn)酸(suān)鈉(nà)，室(shì)溫或(huò)4℃冰箱反應(yīng)20-30分鐘(zhōng)
  。

• 反應(yīng)完後(hòu)裝(zhuāng)入(rù)透析(xī)袋(dài)，對0.001mol/L pH 4.0的醋(cù)酸緩衝(chōng)液透(tòu)析(xī)過(guò)夜，期間更換(huàn)透析液幾次(cì)
  。

• 將(jiāng)恩(ēn)諾沙星用0.01mol/L碳酸(suān)緩衝液(yè)稀釋至(zhì)一定濃(nóng)度(dù)，並(bìng)用(yòng)0.01mol/L碳(tàn)酸緩衝(chōng)液將活化好的過氧化(huà)物酶溶液pH調至9.5左右
  。

• 將恩(ēn)諾沙星溶液(yè)加(jiā)入過氧(yǎng)化物酶溶液(yè)中，室溫(wēn)或4℃反應2小時(shí)
  。

• 加(jiā)入新(xīn)鮮配(pèi)製的(dí)5mg/ml NaBH4溶液，室溫(wēn)作用30分鐘，再加入適量(liáng)NaBH4溶(róng)液，室溫或4℃過(guò)夜
  。

• 最後對0.01mol/L PBS透析(xī)過(guò)夜(yè)，加入保存液於-20℃保(bǎo)存(cún)
  。

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