檸檬(méng)黃(huáng)-過氧化物酶標(biāo)記物的製備方法(fǎ)主要有以(yǐ)下(xià)幾(jī)種(zhǒng)：

過(guò)碘酸鈉(nà)法(fǎ)

• 原(yuán)理(lǐ)：辣(là)根(gēn)過氧化物(wù)酶（HRP）的糖基(jī)用(yòng)過碘酸(suān)鈉(nà)氧(yǎng)化(huà)成醛(quán)基，加入抗(kàng)體(tǐ)IgG後該醛(quán)基(jī)與(yǔ)IgG氨(ān)基(jī)結(jié)合，形成Schiff氏鹼(jiǎn)。為了(liǎo)防止HRP中糖的(dí)醛基與其(qí)自身蛋(dàn)白氨基發生偶合，在用過碘酸鈉(nà)氧(yǎng)化前先用(yòng)二(èr)硝(xiāo)基(jī)氟苯阻斷氨基。氧(yǎng)化反(fǎn)應(yīng)末了(liǎo)，用(yòng)硼氫(qīng)化na穩定Schiff氏鹼。

• 操(cāo)作步驟：

• 將5mg HRP溶於(yú)0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶(róng)液中(zhōng)；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀(yún)，蓋(gài)緊(jǐn)瓶(píng)塞，室(shì)溫(wēn)避(bì)光(guāng)作用(yòng)2小時(shí)。

• 加(jiā)0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混(hùn)匀。

• 加入0.75ml小鼠已(yǐ)處(chǔ)理的腹水，或(huò)純化單(dān)抗等(děng)（15mg/ml），混匀。

• 稱(chēng)取Sephadex G25幹粉0.3g，加入(rù)一支(zhī)下口(kǒu)墊玻璃棉的(dí)5ml注射(shè)器外(wài)筒內；隨(suí)後將上述交(jiāo)聯(lián)物移(yí)入注(zhù)射器(qì)外套(tào)；蓋緊，室溫(wēn)作(zuò)用（避光(guāng)）3小時或4℃過夜(yè)。

• 用少許PBS將交聯物全部(bù)洗出(chū)，收集洗出液，加1/20V體(tǐ)積(jī)新(xīn)鮮配製的(dí)5mg/ml NaBH4溶(róng)液(yè)，混匀(yún)，室溫作用30分鐘；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀(yún)，室溫作用(yòng)1小(xiǎo)時（或4℃過夜）。

• 將交聯物過Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）層(céng)析純化，分管(guǎn)收(shōu)集。

改(gǎi)良過(guò)碘酸(suān)鹽氧化法(fǎ)

• 原理：通(tōng)過(guò)過(guò)碘酸鹽氧(yǎng)化(huà)HRP，使(shǐ)其(qí)產生醛基，然(rán)後(hòu)與檸檬黃特異性(xìng)抗體(tǐ)的氨基結(jié)合(hé)，形成(chéng)穩(wěn)定的標記物。

• 操作步(bù)驟(zhòu)：

• 溶解(jiě)5mg HRP於1ml超(chāo)純水(shuǐ)中(zhōng)，加(jiā)入(rù)新(xīn)配製(zhì)的0.1mol/L多碘酸鈉75μL，置室溫(wēn)或4℃冰箱(xiāng)反(fǎn)應20分鐘或(huò)30分鐘。

• 反(fǎn)應(yīng)完(wán)後裝入(rù)透析(xī)袋，0.001mol/L pH＝4.0醋酸緩(huǎn)衝液(yè)4℃透(tòu)析過夜，期間(jiān)需要更換(huàn)透析液(yè)幾次(cì)。

• 將(jiāng)抗體用0.01mol/L碳(tàn)酸緩(huǎn)衝(chōng)液稀釋(shì)至(zhì)10mg/mL，另外(wài)用(yòng)0.01mol/L碳酸(suān)緩(huǎn)衝液(yè)將活(huó)化好的HRP的(dí)溶液(yè)pH調至(zhì)9.5。將0.5ml抗體(tǐ)加入HRP溶液中，置室溫或4℃冰箱反應2小(xiǎo)時(shí)。

• 加入100μL 4mg/mL硼氫化na，4℃冰箱反應(yīng)2小時(shí)。

• 對(duì)0.01mol/L PBS透(tòu)析(xī)過(guò)夜，加(jiā)入保存液-20℃保(bǎo)藏備用(yòng)。

戊二(èr)醛(quán)法(fǎ)

• 原(yuán)理(lǐ)：戊二醛作為雙功(gōng)能(néng)交(jiāo)聯(lián)劑(jì)，能與(yǔ)HRP和(hé)抗(kàng)體(tǐ)的氨基結(jié)合(hé)，形(xíng)成(chéng)穩定(dìng)的(dí)標(biāo)記物(wù)。

• 操作(zuò)步驟：

• 將5mg AKP加入(rù)1ml抗(kàng)體溶(róng)液(yè)（2mg/ml）中溶(róng)解(jiě)，裝(zhuāng)入(rù)透析袋，於4℃對0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小(xiǎo)時(shí)，換液(yè)三次。

• 加入(rù)2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小(xiǎo)時，4℃對(duì)PBS透(tòu)析過夜，其間換液三次(cì)。

• 換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩(huǎn)衝液(yè)透(tòu)析(xī)，4℃過(guò)夜(yè)，換(huàn)液三次。

• 取出(chū)標記抗體(tǐ)，用(yòng)含1%BSA的(dí)Tris-HCl緩衝液稀(xī)釋至4ml，即為AKP標(biāo)記(jì)物原液。

• 每(měi)毫升中加入(rù)0.4ml甘油，小(xiǎo)量(liáng)分裝(zhuāng)，保(bǎo)存(cún)備(bèi)用(yòng)。

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