Fitc-溶壁酶|FITC-Lyticase

檢測 FITC - 溶壁酶的活性可以(yǐ)采用(yòng)以下(xià)幾種方法：

1.比(bǐ)濁(zhuó)法：

原理：利用溶壁(bì)酶(méi)分解(jiě)細菌細(xì)胞(bāo)壁使(shǐ)懸液中(zhōng)細菌(jūn)細胞(bāo)破(pò)碎，導致懸液濁(zhuó)度降(jiàng)低(dī)，通過測量(liáng)濁(zhuó)度(dù)的變(biàn)化來反(fǎn)映(yìng)酶(méi)的活性
。

操(cāo)作步(bù)驟：

製(zhì)備(bèi)底(dǐ)物(wù)：使用研缽(bō)和(hé)研杵將麵包(bāo)酵母研磨(mó)成(chéng)粉末（細(xì)度(dù)在 25-30 目(mù)之間），用超(chāo)純(chún)水製(zhì)備(bèi)成 4mg/ml 的(dí)酵(jiào)母懸液(yè)
。攪拌(bàn)約(yuē) 1 小時(shí)後，靜置(zhì) 30 分鐘(zhōng)，取上部三分(fēn)之二的上(shàng)清液作為底(dǐ)物
。測量(liáng)底(dǐ)物在(zài) 800nm 處(chǔ)的(dí)吸光度(dù)，吸(xī)光度差(chà)值（）應(yīng)在(zài) 0.7-1.0 之(zhī)間，如有必(bì)要，可調整酵母粉或(huò)超純(chún)水的用量(liáng)來達(dá)到該吸(xī)光度範(fàn)圍(wéi)
。

設置(zhì)反(fǎn)應體係：在比(bǐ)色皿中加入適量(liáng)的(dí)磷(lín)酸鹽(yán)緩衝(chōng)液（67mM 磷酸(suān)鉀緩衝液(yè)，pH7.5，25°C）和一(yī)定(dìng)量(liáng)的 FITC - 溶壁酶溶(róng)液，然後加入調整好的(dí)酵母底物懸(xuán)液，使(shǐ)總體(tǐ)積為 3ml
。

測量(liáng)吸光度變化(huà)：使(shǐ)用(yòng)分(fēn)光光度(dù)計在(zài) 800nm 處，每隔(gé)一(yī)定時間(jiān)（如每分鐘(zhōng)）測量反(fǎn)應混合物的吸(xī)光(guāng)度(dù)值
。單位(wèi)定義(yì)為(wéi)：在(zài) pH7.5
，25°C 下(xià)，在 3ml 反應(yīng)混合(hé)物(wù)中每分鐘使吸光度降低 0.001 的(dí)酶量(liáng)為一個單(dān)位的溶壁酶(méi)活性(xìng)
。

2.熒(yíng)光法：

原(yuán)理(lǐ)：FITC 本身具有熒(yíng)光特(tè)性(xìng)，在一(yī)定(dìng)條(tiáo)件(jiàn)下，FITC - 溶壁酶與底(dǐ)物反應(yīng)後，體係的熒光(guāng)強度(dù)會(huì)發生變化(huà)，通過(guò)檢測熒光強(qiáng)度(dù)的變化(huà)來測定酶(méi)的活性(xìng)
。

操作(zuò)步驟：

製備標準曲綫：使用已(yǐ)知活(huó)性(xìng)的(dí) FITC - 溶壁酶(méi)標準品，在特(tè)定的反應條(tiáo)件(jiàn)下（如一(yī)定的(dí)溫(wēn)度
，pH 值(zhí)和反(fǎn)應時(shí)間(jiān)），與不同濃度的(dí)底物(wù)反應
。反應結(jié)束(shù)後(hòu)，使(shǐ)用熒光分(fēn)光光(guāng)度計(jì)測 量體係的(dí)熒光強(qiáng)度，以酶(méi)活性為(wéi)橫(héng)坐標(biāo)，熒光強度為縱坐(zuò)標，繪(huì)製標準曲(qū)綫
。

樣(yàng)品(pǐn)測定(dìng)：將待(dài)測的(dí) FITC - 溶(róng)壁酶樣(yàng)品在與(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)相同的反(fǎn)應(yīng)條(tiáo)件(jiàn)下與底物反(fǎn)應，反應結(jié)束(shù)後(hòu)測量(liáng)熒光(guāng)強度，根據標(biāo)準曲綫(xiàn)計算出酶(méi)的(dí)活性
。

3.平板(bǎn)法(fǎ)：

原(yuán)理(lǐ)：將 FITC - 溶(róng)壁(bì)酶(méi)作(zuò)用於含有細(xì)菌的平(píng)板培(péi)養(yǎng)基，溶(róng)壁(bì)酶分(fēn)解細(xì)菌細(xì)胞(bāo)壁使細菌細(xì)胞破裂(liè)，形成透明的(dí)溶菌圈，通(tōng)過(guò)測量(liáng)溶(róng)菌圈的大小來判斷酶的活性(xìng)
。

操作步驟：

製(zhì)備含菌平板：將適(shì)量(liáng)的細(xì)菌(jūn)接種到固(gù)體培養(yǎng)基(jī)上(shàng)，培養至(zhì)形成(chéng)均(jūn)匀的(dí)菌(jūn)苔(tái)
。

打孔：在(zài)含菌平板上(shàng)用打孔器打(dǎ)出若(ruò)幹個小孔(kǒng)
。

加樣(yàng)：在(zài)小(xiǎo)孔中加入(rù)一(yī)定量的 FITC - 溶壁酶溶液(yè)，同時(shí)設(shè)置空(kōng)白(bái)對(duì)照（加(jiā)入(rù)等量的緩(huǎn)衝液）
。

培養與(yǔ)觀(guān)察：將(jiāng)平(píng)板(bǎn)放置(zhì)在適(shì)宜的(dí)溫度下培養一(yī)段時(shí)間，觀察小(xiǎo)孔周圍是否(fǒu)出現(xiàn)透(tòu)明的(dí)溶菌(jūn)圈
。測(cè)量溶菌(jūn)圈(quān)的直徑或(huò)麵積(jī)，根(gēn)據(jù)溶菌圈的大小(xiǎo)來判(pàn)斷 FITC - 溶(róng)壁(bì)酶(méi)的(dí)活(huó)性(xìng)
。

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。

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